外泌体是由细胞内多泡体(multivesicular body, MVB) 与细胞膜融合后, 释放到细胞外基质中的直径约40~120nm 的膜性囊泡。几乎所有的细胞， 包括肿瘤细胞、树突状细胞、T细胞等细胞都会分泌外泌体。外泌体广泛存在于各种体液中，可通过循环系统进入其他组织，参与细胞迁移和免疫调节等过程。外泌体具有机体细胞来源的蛋白质、DNA、mRNA、miRNA等成分， 胞内的成分较稳定，不会受到外界核酸酶和蛋白酶的破坏，不同的疾病癌症模型中存在明显的表达差异，体液中外泌体miRNA等可作为疾病诊断的标志物；在样本量足够时，外泌体RNA-seq可以用来数据建模，作为疾病诊断的工具。

我们提供：

从外泌体纯化，文库制备，上机测序到数据分析等整套服务流程，最后提供发表文章级别的可视化结果。

 

技术线路图

 

外泌体提取纯化及检测

对分离后的血浆或血清样本进行外泌体提取纯化，对得到的外泌体样本进行外泌体浓度粒径(NTA)检测和电镜检测，检测合格后提取外泌体RNA。

                     

                                                                   电镜图1                                                                  

 

miRNA文库构建及质检

使用QIAseq miRNA Library Kit进行miRNA文库构建。对构建好的文库进行质检，使用电泳和Agilent 4200 Bioanalyzer检测文库片段的分布，使?QuantStudio 5 Real-Time PCR System和Qubit 3.0检测文库的浓度。

                                           电泳图                                                      文库质检结果图   

 

测序及测序数据质控

使用Fastqc软件进行原始数据质控、Trimmomatic进行去接头和过滤低质量reads、切除长度不合格的序列等步骤，得到clean read于后续的分析。

对数据进行标准化，去除不同批次和测序深度的影响，随后基于所有基因进行主成份分析。

 

数据标准化

下游数据分析

差异分析  使用R 软件 DESeq2 包比较样本的 miRNA 表达水平差异性

富集分析  使用 R 软件 clusterProfiler 包进行基于 GO、KEGG 和 DO 的富集分析，寻找差异表达 miRNA靶标集合内大量基因共同的功能及相关通路。

   

火山图                                                                  热图